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免疫组化操纵步调
第一节 免疫组化操纵步调及抗原修复(供参考)
一、免疫组化操纵步调
(一)、仪器设备

1、 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉

2、 水浴锅

(二)、试 剂

1、 PBS缓冲液(pH7.2―7.4)

2、 0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液(CB,pH6.0,1000ml)

3、 3%甲醇―H2O2溶液:用30% H2O2 和80%甲醇溶液配制

4、 风裱剂:

a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0–9.5)等量混淆

b. 油和TBS(PBS)配制

5、 TBS/PBS pH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;pH7.0-7.4合适光学纤维标本

(三)、操纵流程

1、 脱蜡和水化:脱蜡前应将构造芯片正在室温中安排60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟

a. 构造芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,改换二甲苯后正在浸泡10分钟

b. 无水乙醇中浸泡五分钟

c. 95%乙醇中浸泡五分钟

d. 75%乙醇中浸泡五分钟

2、 抗原修复:用于福尔马林流动的白腊包埋构造芯片

二、抗原修复(免疫组化石蜡切片)

用于福尔马林流动的白腊包埋构造芯片需求抗原修复。

福尔马林流动的构造有可能损坏了本来构造的抗原构造,卵白多肽发作交联,致使局部抗原表位关闭,联合位点削减,以是需求抗原修复,以袒露本来的抗原表位,到达充裕显现抗原,以不泛起显着脱片征象为佳。

抗原修复的几种常用要领(供参考)

1、 微波炉加热:

正在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)至沸腾后将构造芯片放入,断电,距离5-10分钟,重复1-2次。凭据玻片状况可参考接纳微波加热“3-5-3法”3分钟温水沸腾后静止5分钟,再温火沸腾3分钟便可。

实用的抗原:来源于人、大鼠、小鼠的构造标本;来源于其他植物种属的构造标本。

2、 沸热修复:

电炉或水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)至95℃阁下,放入构造芯片加热10-15分钟。

3、 高压热修复:

正在滚水中到场EDTA(pH8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0).盖上不锈钢锅盖,但不克不及锁定。将玻片置于金属染色架上,迟缓加压,使玻片正在缓冲液中浸泡五分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起去。10分钟后撤除热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后翻开盖子。此要领适用于较易检测或核抗原的抗原修复。(骨及软骨构造的标本最好挑选较温文的微波加热修复) 。

4、 酶消化要领:

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶运用前预热37℃,消化工夫约为5-30分钟。

适用于被流动遮盖的抗原:包孕 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等。

三、白腊切片免疫组化染色步调

1、三步法(以SP试剂盒为例)

- 白腊切片脱蜡至水

- 蒸馏水冲刷,PBS浸泡5分钟,若是接纳抗原修复,可正在此步后停止

- 3% H2O2 室温孵育5~10分钟,以消弭内源性过氧化物酶的活性,PBS冲刷,2分钟×3次

- 5~10%一般山羊血清关闭,室温孵育10分钟。倾去血清,勿洗,滴加恰当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃留宿

- PBS冲刷,2分钟×3次

- 滴加恰当比例稀释的生物素符号二抗(1%BSA-PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或滴加第二代生物素符号二抗工作液,37℃或室温孵育10~20分钟

- PBS冲刷,2分钟×3次

- 滴加恰当比例稀释的辣根酶符号链霉卵白素(PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或第二代辣根酶符号链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~20分钟

- PBS冲刷,2分钟×3次

- 显色剂显色(DAB或AEC)

- 自来水充裕冲刷,复染,脱水通明、启片

- 若是需要,可选用avdin关闭内源性生物素

2.SABC法

- 脱蜡、水化

- PBS洗2次各5分钟

- 用蒸馏水或PBS配制新颖的3% H2O2 ,室温关闭5-10分钟,用蒸馏水洗3次

- 抗原修复

- PBS洗5分钟

- 滴加一般山羊血清关闭液,室温20分钟,甩去过剩液体

- 滴加Ι抗50ul,室温静置1小时或4℃留宿或37℃1小时

- PBS洗3次各2分钟

- 滴加生物素化Ⅱ抗,20℃-37℃ 20分钟

- PBS洗3次各2分钟

- 滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟

- PBS洗4次各5分钟

- DAB显色:试剂盒或自配显色剂显色

- 脱水、通明、启片、镜检

四、冰冻切片的免疫组化染色步调

- 速冻构造

- 冰冻切片4~8μm,冰冻切片后如不染色,必需吹干,贮存高温冰箱内,或停止长久预流动后贮存于-20℃冰箱

- 室温安排30分钟后,入4℃丙酮流动10分钟,也可凭据需求挑选其他的流动体式格局

- PBS冲刷,5分钟×3次

- 用3%过氧化氢孵育5~10分钟,消弭内源性过氧化物酶的活性

- PBS冲刷,5分钟×3次

- 下接白腊切片免疫组化染色操纵步调(滴加一抗最先)

第二节 免疫组化抗原热修复的手艺要点(供参考)
一、抗原热修复温度和工夫的干系

我们日常工作中所运用的构造流动液福尔马林会引发构造卵白内或卵白之间的亚甲基发作桥连,详细历程以下:

第一步:根基回响反映福尔马林和氢回响反映构成新的化合物;

第二步:根基回响反映福尔马林和氢回响反映构成新的亚甲基桥。

上述回响反映的效果致使很多抗原决意簇被关闭,而加热能够水解该桥连使抗原被激活。影响抗原热修复的两个最要害的身分是温度和工夫,有人将这两种身分对抗原修复的影响总结为上面的公式: 抗原热修复的有效性=加热温度(T) × 加热工夫(t)。

也就是说当我们修复时的温度越低则需求修复的工夫就越少;反过来当修复温度增高时修复的工夫能够恰当天收缩,才气使抗原决意簇完整袒露,这类反比的干系从MBI单克隆抗体的实行效果“表1”中也能够清晰天看出。

表1 工夫和温度对染色的影响
  • 工夫(分钟)
  • 100℃
  • 80℃
  • 60℃
  • 5×2
  • + + +
  • 5×6
  • + + + +
  • + + +
  • 5×10
  • + + + +
  • +
  • 10小时
  • + +

若是修复强度不敷,免疫组织化学染色所显现的只能是修复后袒露的局部抗原决意簇,而不是构造所露的悉数抗原。如许的染色效果可能会异常强,或泛起假阴性,纵然是阳性效果,充其量只能起到定性的感化,不克不及顺应以后对免疫组化停止定量的需求。那便给我们诊断中定量目标的运用带来难题,比方用来测定耐药的目标。

二、构造流动工夫和所需的抗原热修复的干系

大量的实行注解,流动工夫越少的标本,它所构成的桥连就越严密,抗原就越难以被激活,所需求的修复强度也就越强。有意思的是跟着流动工夫的延伸,构造中卵白对温度的耐受也响应增高,那能够就是我们对流动时间长的标本加大修复强度的理论基础。

那便提示我们正在做回忆性的研讨时一定要注重所运用的修复前提,它取新颖标本的修复前提肯定是有所区分的,一致条件下一定要加长修复的工夫或进步修复所运用的温度,才能够获得对照写意的效果。

三、差别pH值抗原修复液对染色效果的影响

抗原热修复中所运用的修复液pH值也会对染色效果发生相称大的影响。

pH值对染色效果的影响也许能够分为以下四种状况:

A.稳固型,pH值对染色效果影响不大,如PCNA、AE1、EMA、CD20等;

B.V型,下pH值和低pH值染色较好,而pH值4-5染色效果较差,如ER、Ki-67等;

C.上升型,跟着pH值的增添,染色效果逐步加强,如HMB45等;

D.下落型,跟着pH值的增添染色效果逐步削弱,固然这类范例的抗体只是个体的征象,如MOC31。

一个风趣的征象值得注重,即正在下pH值都有较好的染色效果,以是现在对照推许的抗原修复液为下pH值得修复液,如1mMEDTA, pH8.0或pH9.0等。然则因为传统风俗,绝大多数病院和实验室皆正在运用pH6.0的枸橼酸缓冲液。综合以上种种抗体的染色状态,考虑到临床事情的实际情况,很多外洋免疫组化专家建议,正在通例的免疫组化工做中,悉数选用下pH值得修复液去替代现在广为运用的pH6.0枸橼酸缓冲液。为此,本公司曾经推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修复液。履历证,绝大多数的抗体运用pH9.0得修复液结果皆要优于pH6.0的枸橼酸,尤其是核阳性的抗体。以是,正在通例的免疫组化工做中,运用下pH值的抗原修复液是以后的一定趋向。

四、抗原热修复的手腕
表2 微波炉修复和高压锅修复的对照
  • 温度
  • 压力
  • 工夫
  • 受热
  • 微波炉
  • 100℃
  • 1P
  • 15~20分钟
  • 不均匀
  • 高压锅
  • 120℃
  • 1.2P
  • 喷气2分钟
  • 匀称

现在抗原热修复所接纳的要领重要有微波炉修复和高压锅修复两种,从“表2”中能够看出,因为高压锅修复具有温度均一、节约工夫、结果稳固等特性,曾经愈来愈遭到人们的喜爱。

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